O que é “pré-tratamento” na metagenômica?
Sem dúvidas, a metagenômica revolucionou a biotecnologia por permitir, através do sequenciamento de materiais genéticos disponíveis, a identificação de todos microrganismos presentes em dada amostra. Mas apesar dos avanços tecnológicos, as leituras metagenômicas ainda estão sujeitas ao que chamamos de “ruído técnico”, isto é, a fragmentos de leitura que não refletem fielmente a população analisada, mas que ainda assim aparecem como “resultados” nas leituras iniciais.
Além disso, existem limitações inerentes às próprias plataformas de sequenciamento, que possuem uma capacidade máxima de leituras por amostra, independentemente da quantidade e diversidade real de material genético presente – uma limitação intitulada “profundidade de sequenciamento”.
Por isso, antes de submeter qualquer informação colhida às fases de processamento de dados e aos parâmetros oficiais de análise metagenômica, faz-se necessária uma triagem preliminar que revisa e corrige a influência dos ruídos e das limitações do equipamento. Essa triagem é justamente o que chamamos de pré-tratamento, e ela pode incluir até três principais fases.
Pré-tratamento na prática: entenda cada etapa dessa triagem
A primeira etapa de pré-tratamento é altamente recomendada em todos os casos de análise metagenômica, e visa a remoção dos ruídos da amostra. Destacam-se dentre os ruídos a serem removidos:
- Adaptadores: Pequenas sequências de DNA alheias aos microrganismos da amostra, mas que são indispensáveis para que se possa sequenciar o material genético de interesse;
- Leituras de baixa qualidade: Aquelas nas quais a identificação de algumas bases nitrogenadas falhou, de modo que ainda que a sequência genética seja inicialmente contabilizada pelo aparelho, a incerteza de tantas bases inviabiliza a caracterização da sequência na análise final;
- Leituras redundantes: Quando uma mesma sequência genética existe em réplica, evita-se seu sequenciamento repetido pois ele desperdiça o potencial de profundidade de sequenciamento da ferramenta utilizada sem contribuir para a determinação da composição taxonômica da amostra.
Todos os ruídos acima são removíveis por softwares de limpeza dos dados (como o CutAdapt, Sickle, Trimmomatic e AdapterRemoval). Contudo, existe ainda uma outra espécie de ruído, a interferência do hospedeiro, mas que devido à sua excepcional influência no contexto de metagenômica shotgun, recebe uma etapa individual no pré-tratamento.
Diferentemente do processo de amplicon, na metagenômica shotgun, na qual são coletadas as sequências de todos os microrganismos presentes na amostra. Nesse contexto, é possível que mesmo após a etapa de limpeza dos dados, ainda seja necessária a remoção dos dados relacionados ao material genético do hospedeiro do ambiente da amostra (como DNA de células das paredes do intestino, por exemplo, em caso de amostragem da microbiota gastrointestinal). Assim, pode haver necessidade da segunda etapa de pré-tratamento – a descontaminação hospedeira, que pode ser realizada com softwares como o Bowtie 28, DeconSeq e BWA-MEM.
As duas etapas acima compõem o que se chama de controle de qualidade. Porém, se a análise tiver por objetivo comparar amostras em termos de riqueza de microorganismos presentes, uma última etapa de pré-tratamento, denominada subamostragem, faz-se necessária.
A subamostragem é especialmente importante nos casos em que os tamanhos das amostras comparadas por metagenômica são diferentes, o que por sua vez pode resultar da limitação da profundidade de sequenciamento da ferramenta de análise disponível. É fácil pensar, por exemplo, que uma amostra sequenciada com um aparelho que computa só até 1 milhão de leituras pode ter menos microrganismos identificados do que uma amostra computada com até 10 milhões de leituras, mesmo que a primeira possa ser, na prática, mais rica. Nesse caso, a segunda mostra apenas teve a chance de ter mais de seus microrganismos identificados, enquanto a leitura reduzida da primeira amostra pode ter omitido a presença de alguns microrganismos, principalmente os mais raros.
Em contextos como este, que envolvem comparações amostrais, o pré-tratamento ainda analisa os dados para determinar se as amostras coletadas são de tamanho estatisticamente suficiente, e, caso necessário, realiza a etapa da subamostragem, que “desconsidera” parte dos dados obtidos a fim de nivelar o tamanho das amostras para que uma comparação mais exata dos resultados.
Mas a manipulação dos dados não invalida os resultados?
Não! Sabendo das limitações intrínsecas aos processos de metagenômica, as ferramentas de análise bioinformática já identificam e manipulam, caso necessário, apenas as fontes de ruídos e distorção dos dados coletados, sem comprometer a confiabilidade da análise propriamente dita. Nesse sentido, Richa Bharti e Dominik Grimm (2021) apontam que a falta de um processo de controle prévio dos dados reduz significativamente a reprodutibilidade e consistência dos experimentos. O pré-tratamento é, justamente, uma ferramenta de preparação dos resultados para que estes permitam uma análise final mais precisa e certeira.
Benefícios do pré-tratamento:
A composição das etapas do pré-tratamento dá origem ao sistema computacional que chamamos de pipeline. Além de aumentar a qualidade e precisão dos seus resultados, um bom pipeline prevê erros e otimiza o processo da análise, ajudando, assim, a reduzir seus custos de execução do projeto.
Na Protos Biotec Jr., adaptamos as etapas de pré-tratamento de análises metagenômicas às necessidades específicas de cada cliente. Buscamos conhecer cada caso e objetivos em detalhes para orientar e acompanhar nossos parceiros durante todas as escolhas desse processo tão importante.
Ficou interessado? Entre em contato conosco!
Referências:
BHARTI, Richa; GRIMM, Dominik G. Current challenges and best-practice protocols for microbiome analysis. Briefings in Bioinformatics, Oxford, v. 22, n. 1, p. 178–193, 2021. DOI: 10.1093/bib/bbz155. Disponível em: https://doi.org/10.1093/bib/bbz155. Acesso em: 29 jul. 2026.
QUINCE, C.; WALKER, A. W.; SIMPSON, J. T.; LOMANS, N. J.; SEGATA, N. Shotgun metagenomics, from sampling to analysis. Nature Biotechnology, v. 35, n. 9, p. 833–844, 2017. DOI: 10.1038/nbt.3935. Acesso em: 22 jul. 2026.
LEANDRO, R. M. Análise de dados de metagenômica obtidos de amostras de solo: caracterização taxonômica, do resistoma e do viruloma. 2025. Trabalho de Conclusão de Curso (Bacharelado em Engenharia Eletrônica) – Universidade Tecnológica Federal do Paraná, Campus Toledo, Toledo, 2025. Acesso em: 21 jul. 2026.
YOUSSEF, Noha H.; ELSHAHED, Mostafa S. Species richness in soil bacterial communities: a proposed approach to overcome sample size bias. Journal of Microbiological Methods, v. 75, n. 1, p. 86–91, 2008. DOI: 10.1016/j.mimet.2008.05.009. Acesso em: 22 jul. 2026.